Магистерская диссертация на тему: Обзор литературы. Дный состав меда. Известно, что основную часть меда составляют углеводы, такие как

Введение

2.1.Углеводный состав меда

Известно, что основную часть меда составляют углеводы, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза и др. Суммарное содержание углеводов в меде составляет около, причем в созревшем меде 80-90% приходится на глюкозу и фруктозу, 5-6% на сахарозу [1.2]. Содержание воды в зависимости от типа и зрелости меда составляет примерно 18%. Оставшиеся 2-3% приходятся на различные полифенольные соединения и микроэлементы, которые обеспечивают лечебные и антиоксидантные свойства меда.

Моносахариды (фруктоза и глюкоза) образуются из дисахарида - сахарозы под действием ферментов, содержащихся в пчелиной слюне[2].

Рис 1. Образование фруктозы и глюкозы из сахарозы под действием ферментов.

Содержание восстанавливающих моносахаридов (глюкоза и фруктоза) и сахарозы в меде строго регламентировано [1]. В процессе переработки меда для осуществления контроля над процессом необходимо знать точное содержание моно- и дисахаридов. Изменение количественного соотношения моносахаридов

свидетельствует о нарушении технологических процедур процесса переработки меда.

Метод количественного анализа углеводов в меде приведен в ГОСТ [1]. В основе метода лежит определение оптической плотности раствора феррицианида калия после того как он прореагирует с восстанавливающими сахарами меда. Предложенный метод анализа заключается в определении сахаров меда до и после процесса инверсии. Следует отметить, что данный метод анализа является косвенным и не позволяет установит точное содержание каждого из моносахаридов. Также этим методом невозможно однозначно определить содержание сахарозы, так как в меде может содержаться мальтоза и другие ди- и олигосахариды.

В литературе описаны более точные способы определения углеводов [3,4], основанные на применении различных методов анализа. Так, описываются некоторые варианты изотопного анализа [5-10]. На их основе был разработан и включен в список официальных методик метод определения добавки сахарного сиропа к фруктам и меду [11].

В 60-х годах прошлого века были начаты исследования по применению метода тонкослойной хроматографии для количественного определения углеводов в меде [12], были получены первые хроматографические профили различных сортов меда. Вместе с методом ТСХ широко применялся метод газовой хроматографии [13-17]. Главным недостатком этого метода является необходимость проведения процесса дериватизации углеводов, что в значительной степени затрудняет проведение анализа и увеличивает его продолжительность.

В последнее время широкое распространение получил метод ВЭЖХ [18]

в сочетании с различными вариантами детектирования [19- 22]. Первые результаты по использованию этого метода анализа для количественного определения углеводов были описаны в 80- годах прошлого века. В качестве сорбента был использован силикагель, модифицированный аминофазой, и

рефрактометрический детектор [23]. При таком варианте возникала вероятность образования оснований Шиффа [24, 25]. Современные аминофазы позволяют избежать этого явления. Кроме того для анализа углеводного состава меда можно применить ионообменный вариант жидкостной хроматографии [23.27]с амперометрическим детектором. Вместе с указанными методами для анализа углеводов можно применить метод капиллярного электрофореза в сочетании с непрямым УФ-детектированием [28]. Разработка передовых технологий и получение новых материалов [29-31 позволит определять целый ряд сахаров в меде , что открывает возможность идентификации меда по ботаническому происхождению.

2.2. 5-ГМФ в меде

5- ГМФ (5-гидроксиметилфурфурол) представляет собой циклический альдегид, являющийся продуктом распада моносахаридов под действием кислот [33]. Таким образом, он содержится во всех натуральных продуктах, в составе которых есть вода имоносахариды в кислой среде.

Сема образования 5-ГМФ из фруктозы

Следует отметить, что 5-ГМФ не является исходным компонентом меда. Он обычно образуется из пентоз при длительном хранении и переработке меда [33]. Кетопентозы, такие как фруктоза, проявляют повышенную реакционную способность и образуют 5-ГМФ по сравнению с альдогексозами, представителем которых является глюкоза.

Накопившийся в первые месяцы хранения 5- ГМФ под действием ферментов разрушается, образуя нетоксичные вещества. Активность ферментов при длительном хранении резко снижается, что приводит накоплению 5-ГМФ в значительном количестве Так в свежеоткачанном меде содержание 5-ГМФ не превышает 5 мкг/кг, а после нескольких лет хранения его количество составляет 150-200 мкг/кг. Нагревание меда также приводит к резкому повышению концентрации [33-36], что является признаком нарушения технологического процесса переработки меда [37-38]. Количество 5-ГМФ может увеличиваться из-за гидролиза сахарозы., поэтому показатель содержания 5-ГМФ может быть использован для анализа качества меда.

Согласно российскому стандарту на качество меда предельно допусти

мое содержание 5-ГМФ равно 25 мг/кг [1]. Европейские нормы ограничивают ПДК 5-ГМФ концентрацией 40 мг/мл [40].

Описаны качественная реакция на 5-ГМФ и методика количественного определения 5-ГМФ, основанная на методе спектрофотометрического определения в присутствии барбитуровой кислоты и п-толуидина (метод Винклера) [2. 41. 42]. Измерение показателя поглощения раствора по отношению к контрольному образцу следует проводить ежеминутно в течение 6 минут. К сожалению, данный метод требует применение токсичных веществ, жесткого контроля над временем проведения реакции и температурой одновременно, и сильно зависит от качества реактивов.

Наряду с указанными методами для определения 5-ГМФ используются

методы газовой хроматографии [43, 44]. Наиболее удобным является метод

ВЭЖХ [45- 47], так как позволяет определить не только 5-ГМФ, но и некоторые другие продукты [48], и не требует дериватизации определяемых компонентов. В литературе описано несколько ВЭЖХ методик определения 5-ГМФ в меде.

В работе [49] описана методика количественного определения 5-ГМФ методом ВЭЖХ с детектированием на анодно-матричном детекторе при длине волны 284 нм (УФ область).

2.3. Определение антибиотиков в меде

Химические остатки ветеринарных препаратов, таких как стрептомицин, хлорамфеникол, макролиды, сульфонамиды, тетрациклины, хинолоны и аминогликозиды и другие загрязнители, такие как пестициды и тяжелые металлы, были обнаружены в меде, что вызывает опасения для здоровья человека. Действительно, растет интерес к их присутствию и стойкости в окружающей среде, поскольку низкие уровни антибиотиков могут способствовать размножению устойчивых к антибиотикам бактерий. Кроме того, антибиотики, присутствующие в меде, могут образовывать остатки в пищевых продуктах, вызывая неблагоприятные воздействия на людей, такие как аллергические реакции, токсические эффекты и повреждение центральной нервной системы. По соображениям продовольствия и здоровья / безопасности антибиотики не разрешены для лечения медоносных пчел в ЕС, хотя эти противомикробные препараты были одобрены во многих странах третьего мира. По этой причине загрязненные медовые продукты все еще можно найти на европейских рынках. Следовательно, существует необходимость в разработке точного, точного и чувствительного аналитического метода, который можно использовать для простого и быстрого обнаружения этих соединений в мёде. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы обнаружить присутствие антибиотиков в апулийском мёде с использованием антимикробной матрицы II (АМ II) в качестве инновационного метода скрининга для проверки качества здоровья мёда и медовых продуктов

В меде могут находиться представители всех 5 групп антибиотиков.

Преимущественный путь их попадания в мед - нарушение ветеринарных

норм при лечении пчел от различных заболеваний.

Макролиды - группа веществ, широко применяющаяся в медицине и

ветеринарии. Макролиды представляют собой класс антибиотиков, основу

химической структуры которых составляет макроциклическое лактонное

кольцо. В зависимости от числа атомов углерода в кольце макролиды под

разделяются на 14-членные (эритромицин, рокситромицин, кларитромицин),

15-членные (азитромицин) и 16-членные (мидекамицин, спирамицин, джозамицин). Основное клиническое значение имеет активность макролидов в отношении грамположительных кокков и внутриклеточных возбудителей (микоплазмы, хламидии, кампилобактеры, легионеллы). Антимикробный эффект обусловлен нарушением синтеза белка на рибосомах микробной клетки.

Макролиды относятся к числу наименее токсичных антибиотиков [62, 63]. Кроме антибактериального действия макролиды обладают иммуномодулирующей и умеренной противовоспалительной активностью.

В пчеловодстве макролиды применяются для лечения таких заболева

ний, как Американский гнилец, Гафниоз, Салъмонеллез (паратиф), Колибак-

териоз, Цитробактериоз, которые могут оказать разрушительное действие

на пчелиную семью. Данная группа антибиотиков показывает высокую активность по отношению к возбудителям указанных заболеваний [64- 66].

Рис. 2. Химическая структура некоторых макролидов

Во многих странах содержание макролеидов в пчелопродуктах строго

регламентировано. Так, согласно требованиям канадских контролирующих

организаций макролеидов в меде содержаться не должно [70]. Европейские

нормы допускают присутствие остатков некоторых макролидов в меде, на

пример для тилозина ПДК определяется 40 нг/г [71]. При соблюдении всех ветеринарных норм к началу медосбора в улье не должно оставаться даже

следовых количеств этих веществ.

Сульфатиазол и окситетрациклин, вероятно, являются первыми антибиотиками, применяемыми для борьбы с болезнями пчел. Начиная с 1980-х годов были разработаны аналитические методы для этих двух лекарственных препаратов в мёде на следовых уровнях, основанные, главным образом, на жидкостной хроматографии в сочетании с UV-Vis (LС-UV-Vis) и флуоресцентными детекторами (LС-FLD). В начале 2000-х годов доступность систем жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическими анализаторами (ЖХ-МС) на уровне стенда включала в себя прогрессивную разработку процедур, использующих эту технику, которая обеспечивает более избирательное и универсальное обнаружение, чем традиционные детекторы, основанные на УФ-поглощении ( вполне универсальный, но не селективный)

Для качественного определения наличия остатков антибиотиков в продуктах питания широко применяется тест Чарма II, микробиологическое ингибирование и исследование микробных рецепторов [92- 95], а также химические методы анализа [96]. Так, тест Чарма II применяется для определения

тилозина и эритромицина в меде с пределами детектирования в 800 и 200 ppb

соотвественно. Упомянутые выше тесты имеют существенные недостатки,

такие как:

- они не всегда могут определить какой именно антибиотик содержится в анализируемом образце, чаще всего тест подтверждает/опровергает факт

наличия антибиотика как такового.- результаты теста могут быть положительными даже при содержании антибиотиков в количестве, значительно меньшем установленных ПДК [97,98].

Все сомнительные образцы или давшие положительный результат после проведения контрольных тестов могут быть исследованы более точными

методами, например ВЭЖХ-МС/МС.

Амфениколы - группа антибиотиков, широко применяющаяся в ветеринарии и медицине. К основным представителям этой группы относят хлорамфеникол, флорфеникол, тиамфеникол. Хлорамфеникол проявляет высокую активность против различных болезнетворных микроорганизмов, включая аэробные и анаэробные грамположительные и грамотрицательные бактерии, рикеттсии, микоплазму и хламидии. Механизм антимикробного действия хлорамфеникола (левомицетина) связан с нарушением синтеза белков микроорганизмов. Он блокирует полимеризацию активированных аминокислотных остатков, связанных с матричной РНК. Устойчивость микроорганизмов к хлорамфениколу развивается относительно медленно, при этом, как правило, перекрестной устойчивости к другим химиотерапевтическим средствам не возникает. В пчеловодстве используется для лечения такого заболевания, как парагншец. Несмотря на свои свойства, он не применяется в медицине, так как при его использовании были обнаружены случаи возникновения апластичной анемии у человека [99]. Данный факт послужил основанием для запрета на его использование в США и ЕС [100, 101]. В тоже время тиамфеникол и флорфеникол, имеющие схожую с хлорамфениколом химическую структуру были разрешены к использованию, как его заместители. Для них были определены ПДК, тогда как хлорамфеникол был запрещен к использованию в медицине [102]. Для хлорамфеникола установлен рекомендованный уровень обнаружения в 0,3 мкг/кг [101]. Несмотря на запрет к использованию, хлорамфеникол часто обнаруживают в продукта хпитания (преимущественно аквакультуры), произведенных в Китае и Вьетнаме [103,104].

В литературе встречается ограниченное число публикаций по методам

анализа амфениколов в пищевых продуктах, а особенно в пчелопродуктах.

Амфениколы хорошо экстрагируются из биологических материалов органическими растворителями. Однократное перемешивание с этилацетатом достаточно для количественной экстракции хлорамфеникола [105] и флорфеникола из молока [106]. В случае с медом задача осложняется тем, что в органическую фазу вместе амфениколами переходит практически вся полифенольная часть меда (флавоны, флавоноиды, катехины, органические кислоты и их эфиры и др.), что существенно осложняет проведение дальнейшего анализа.

Амфениколы поглощают в УФ-спектре и могут быть детектированы

УФ-детектором. Так, максимум поглощения хлорамфеникола приходится на

278 нм, для тиамфеникола и флорфеникола максимум адсорбции лежит в

пределах 225-230 нм [107-110]. Однако, применение ВЭЖХ с УФ-

детектированием для определения следовых количеств амфениколов в про

дуктах питания практически невозможно из-за недостатка чувствительности

УФ-детекторов. По этой причине распространение получают ВЭЖХ методы

в сочетании с различными вариантами масс-спектроскопии, как масс-спектроскопия с ионизацией при атмосферном давлении, с химической ионизации, тандемная масс-спектроскопия, с ионизацией заряженными частицами[111-123]. Так, например, в работе [124] описана ВЭЖХ методика анализа хлорамфеникола в сочетании с масс-спектроскопическим детектрованием

при положительной ионизации. Другими авторами [125] описывается ВЭЖХ-

МС методика определения хлорамфеникола в плазме, молоке и мышечных

тканях. В качестве внутреннего стандарта был применен дейтерированный

хлорамфеникол. В отличие от работы [126] здесь максимальная чувствительность была достигнута в режиме отрицательной ионизации.

Наряду с жидкостной хроматографией применяются методы газовой

хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией [124, 127, 128]. Данные

методы предполагают проведение дериватизации амфениколов, что осложняет процесс анализа и увеличивает время его проведения.

Также сообщается о применении метода ТСХ для анализа антибиотиков амфеникольного ряда [129 - 134].

Тетрациклины - группа антибиотиков, включающая тетрациклин и

его производные. Исторически первый представитель этой группы - хлортетрациклин - был выделен в 1948 [135] из культуральной жидкости Streptomyces aureofaciens. В дальнейшем активные антибиотики стали выделять из

Streptomyces rimosus (природные тетрациклины). Природные тетрациклины

являются сырьем в производстве полусинтетических тетрациклинов [136,

137]. Химические структуры наиболее распространенных представителей

этого класса соединений приведены на рис 4.

Рис. 4. Структуры некоторых тетрациклинов

Тетрациклины - антибиотики широкого спектра действия. Они активны в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий. Особенно эффективны тетрациклины в отношении стафилококков, пневмококков, гонококков, возбудителей холеры, дизентерии, рикеттсий. хламидий и

микоплазм, однако в процессе их многолетнего использования многие бактерии приобрели к ним резистентность. Механизм антибактериального действия тетрациклинов основан на подавлении ими синтеза белка микробной клетки [137, 138].

В пчеловодстве тетрациклины используются для лечения таких заболеваний пчел как септицемия, спироплазмоз, парагнилец [139-141]. Окситетрациклин, тетрациклин и доксициклин наиболее часто применяются в сельском хозяйстве и, в частности, в пчеловодстве, так как имеют широкий спектр действия и относительно невысокую стоимость. Однако есть определенные причины для использования других представителей тетрациклинового ряда. Так, миноциклин имеет наибольшую биологическую активность из всех тетрациклинов и активность против тетрациклин-устойчивых патогенных организмов; метациклин и димеклоциклин более стабильны, чем тетрациклин, иобеспечивают более продолжительное фармакологическое действие при меньших концентрациях в крови и более редких интервалах применения; ролитетрациклин более активно растворяется в воде, чем остальные тетрациклины, что делает его более пригодным применения для инъекций. Хлортетрациклин имеет сильные побочные действия и поэтому снят с применения в медицине. Используется как исходное вещество в процессе синтеза полусинтетических

тетрациклинов.

Широкое применение тетрациклинов требует точного и своевременно

го контроля их содержания в продуктах питания. Наиболее часто для этого

применяются микробиологические тесты. Однако они занимают много времени, не позволяют идентифицировать отдельные тетрациклины, и недостаточно точны. Поэтому в настоящее время разрабатываются различные ВЭЖХ

методы анализа тетрациклинов.

Тетрациклины проявляют схожие химические и физико-химические

свойства. Это амфотерные вещества с характерным значением рН, способные

Оглавление

- Выводы

- Список литературы

- Приложение

Список литературы

- Сrаnе, Е.// А bоок оf hоnеy. Оxfоrd Univеrsity Рrеss, Оxfоrd, Nеw Yоrк,Тоrоntо, Меlbоurnе.

- Gооdаll, I.; Dеnnis, М.J.; Раrкеr, I.; Shаrmаn, М. "Соntributiоn оf highреrfоrmаnсе liquid сhrоmаtоgrарhiс аnаlysis оf саrbоhydrаtеs tо аuthеntiсity tеsting оf hоnеy" Jоurnаl оf Сhrоmаtоgrарhy А, Vоlumе 706, Issuеs.

- July 1995, Раgеs.

- Соttе, J. F.; Саsаbiаnса, Н.; Сhаrdоn, S.; Lhеritiеr, J.; Grеniеr-Lоustаlоt.

- М.F., "Аррliсаtiоn оf саrbоhydrаtе аnаlysis tо vеrify hоnеy аuthеntiсity".

- Jоurnаl оf Сhrоmаtоgrарhy А, Vоlumе 1021, Issuеs 1-2, 22 Dесеmbеr.

- Раgеs.

- Веndеr, М.М. "Маss sресtrоmеtriс studiеs оf саrbоn 13 vаriаtiоns in соrn.

- Аnd оthеr grаssеs."/ Rаdiсаrbоn 10 (1968).

- М.М. Рhytосhеmistry 10 (1971).

- Саsаbiаnса, Н.; Реrruсhiеtti, С ; Jаmе, Р.; Grеniеr, С ; Соttе, J.F.; Веrtrаnd, М.С.; Кustnеr, D. Аnn. Fаls. Еxр. Сhim. 51 (2000).

- Whitе, j.w.; wintеrs, к. j. аоас. 72 (1989).

- Whitе, j.w.; j. аоас. 75 (1992).

- Whitе, J.W.; Wintеrs, К. J.; Маrtin, Р.; Rоssmаn, J. АОАС. 81 (1998).

- Оffiсiаl Меthоds оf Аnаlysis, 5th Rеvisiоn, АОАС Intеrnаtiоnаl, Gаithеrsburg, МD, 16th еd., 1999, Меthоd.

- Роurtаlliеr, J. Вull. Арiс. (1964).

- Роurtаlliеr, J. Вull. Арiс. 2 (1967).

- Siddiqui, I.R.; Furgаlа, В. J. Арiс. Rеs. 6 (1967).

- Siddiqui, I.R.; Furgаlа, В. J. Арiс. Rеs. 7 (1968).

- Масlnnеs, А.G.; Ваll, D.Н.; Соореr, F.Р.; Вishор, J., "Sераrаtiоn оf саrbоhydrаtе dеrivаtivеs by gаs-liquid раrtitiоn сhrоmаtоgrарhy" Jоurnаl оf.

- Сhrоmаtоgrарhy А, Vоlumе 1, 1958, Раgеs.

- Маtео, R.; Воsсh, F.; Раstоr, А.; Jimеnеz, М., "Сарillаry соlumn gаs.

- Сhrоmаtоgrарhiс idеntifiсаtiоn оf sugаrs in hоnеy аs trimеthylsilyl dеrivа.

- Tivеs" Jоurnаl оf Сhrоmаtоgrарhy А, Vоlumе 410, 1987, Раgеs.

- Swаllоw, К.W.; Lоw, N.Н. "Аnаlysis аnd quаntitаtiоn оf thе саrbоhydrаtеs.

- In hоnеy using high-реrfоrmаnсе liquid сhrоmаtоgrарhy"/ J. Аgriс. Fооd.

- Сhеm., 38 (1990).

- Rоскlin, R.D.; Роhl, С.А. "Dеtеrminаtiоn оf Саrbоhydrаtеs by Аniоn